今天推送的文章是发表在Food Chemistry上的“Directed evolution of maltogenic amylase from Bacillus licheniformis R-53:Enhancing activity and thermostability improves bread quality and extends shelf life”，通讯作者是来自江南大学生物工程学院的张荣珍教授。
麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)是糖苷水解酶家族13的成员；这种酶具有独特的催化多功能性和多底物特异性。麦芽糖淀粉酶可以将支链淀粉水解成麦芽糖和小分子糊精，它们太短而不能结晶和形成结晶区。在面包中添加麦芽糖淀粉酶可以干扰淀粉颗粒和蛋白质大分子的缠绕，减少淀粉的重结晶。因此，麦芽糖淀粉酶可以延缓面包的老化和延长其保质期，并且经常用于面包烘焙和储存。麦芽糖淀粉酶需要在特殊的温度和pH范围内具有高的酶活性和稳定性，才能在面包制造行业发挥良好的效果。作者以前的研究报道了来自地衣芽孢杆菌R-53的一种新的麦芽糖淀粉酶(BLMA)，其最适温度为60◦C，热稳定性为30~80◦C。但大多数小麦淀粉在温度>60◦C时开始糊化并开始被酶作用，如果酶的最适温度低于60◦C，则在淀粉未完全糊化的温度下，酶已失活，使这些酶难以发挥作用。因此，更高的最适温度(65-75◦C)和更好的热稳定性(30-85◦C)将是提高面包工业中BLMA的价值所必需的。
本研究旨在培育一种更好地应用于面包工业的BLMA突变株。首先，利用EP-PCR技术构建了BLMA随机突变文库。其次对产生的点突变进行了筛选，构建了双突变体BLMA1，与野生型BLMA相比，BLMA1具有更高的活性、更高的最适温度和更好的热稳定性。在烘焙试验中，与野生型BLMA相比，BLMA1改善了面包质量，延长了保质期，而且可以大大降低应用剂量。
在PCR反应体系中加入不同浓度的Mn2 (0.1-1.0 mM)，对编码BLMA的基因进行随机突变。构建了10个突变文库。随着Mn2 浓度的增加，碱基错配率增加。当Mn2 浓度为0.4或0.5 mM时，突变率为2-5个突变株/kb，这是一个理想的水平。在此条件下，构建了两个约8000个克隆的随机突变文库。从每个突变文库中随机选择300个突变体。阳性突变体能够水解淀粉，从而在含有Lugol’s 碘液的平板上形成透明的圆圈。因此，第一轮筛选将这些突变体应用于含有Lugol’s 碘液的LB-琼脂平板。培养后，培养皿上出现大量透明圆圈。测量产生透明圈的菌落直径(r)和对应的透明圈直径(R)，从每块平板中选出HC值(R/r)最大的10个菌落。虽然透明圈的大小直接反映了菌株的产酶能力，但不能完全代表酶活的大小，因此，在第二轮筛选中，采用了DNS法测定其酶活。在实验过程中，由于96孔板可以方便地同时进行分批培养，节省大量的实验时间，所以采用平板培养法对这些阳性突变体进行培养。离心后收集上清液，对阳性突变株进行酶活测定，筛选出OD值>0.6的突变株。研究发现，阳性突变体的成员急剧减少(从200减少到40)。其中，E1、I1、L5、Q1、Q3、S2、S7的OD值均大于1.0。在第三轮筛选中，突变株在250mL摇瓶中培养，用DNS法测定酶活性。与野生型相比，选择了酶活性较高的突变体。经过三轮筛选，筛选出酶活为野生型BLMA的1.42倍和1.84倍(p<0.05)的突变体，分别命名为MT1和MT2。确定了MT1和MT2活性的最适温度。如表1所示，MT1的最适温度提高到65◦C，而野生型BLMA的最适温度为60◦C。
通过DNA测序，发现MT1与野生型相比有5个氨基酸替换：Ala51Thr、Asp218Asn、Val296Phe、Thr401Ile和Lys418Ile。在MT2中发现了三个氨基酸替换：Ser110Val，Thr267Glu和Glu397Lys。为了确定在突变体MT1和MT2中哪些位点起主要作用，构建了单点突变用于进一步的实验。测定了与野生型BLMA相比的相对酶活性和突变株的最适酶活温度。如图1a所示，不同的突变体表现出非常不同的酶活性。突变体E397K的活性最高，是野生型BLMA的1.76倍。突变T401I对酶活力有抑制作用，酶活力下降约20%。野生型和大多数突变株的最适温度为60◦C，而突变株S110V的最适温度为55◦C。
图1
单点突变不能复制多点突变株MT1和MT2的酶活性。因此，作者通过结合在MT1和MT2中发现的单个突变进行了进一步的实验。将MT1和MT2的单点突变随机组合，构建了28个双点突变。所有突变体均获得成功表达，重组酶得到纯化。以野生型BLMA为对照，测定了这些突变体的酶活性。突变体V296F/K418I的活性最高，是野生型BLMA的2.16倍(图1B)。这个突变体被命名为BLMA1。
如图2a所示，BLMA1活性的最适温度为65◦C，而野生型BLMA的最适温度为60◦C。在55~80◦C的温度范围内，BLMA1的最大活性仍保持在75%以上。因此，BLMA1具有比野生型酶更宽的工作温度范围和更好的高温淀粉水解率。如图2B所示，当BLMA1在55~80◦C的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中处理30min时，残存酶活性>60%。在55~80◦C的热稳定性表明，BLMA1在面包烘焙过程中可以催化淀粉转化为麦芽糖。在85◦C下孵育30min后，BLMA1的残酶活力约为30%，而BLMA的残酶活力仅为9%。BLMA1在90◦C处理30min后失去活性。这些结果表明，在面包烘焙完成之前，BLMA1的活性不会完全丧失，这不会对面包质量产生负面影响。通过对BLMA1酶活、最适酶活温度和热稳定性的提高，突变体BLMA1在面包烘焙行业中的应用效果可能比BLMA更好。
图2
与BLMA相比，BLMA1酶性质的改善与其结构的变化密切相关。根据DynaMut的分析，BLMA1和BLMA的全局结构几乎相同。单个突变体V296F的酶活性是野生型BLMA的1.54倍，这可能是由于蛋白质中氨基酸残基之间形成了更多的氢键和疏水作用(图3A)。更多的键可能增加蛋白质结构的刚性和稳定性，并可能影响酶的活性。一方面，蛋白质的热稳定性与氢键的数量呈正相关，图3A显示突变残基与周围残基之间形成了额外的氢键，这可能增加残基与周围氨基酸的结合强度。另一方面，图3A显示疏水相互作用增强，这与我们的认知不同：Val的疏水相互作用强于Phe。造成这种现象的原因可能是疏水相互作用有一定的距离，原来的296V有很强的疏水相互作用，导致空间位阻很大。但Phe取代Val后，其疏水性较弱，空间位阻变小，与其他氨基酸残基形成额外的疏水相互作用。基于V296F突变后的结构，418残基周围的结构如图3B所示。该位点周围疏水相互作用的增加和静电相互作用的减少也可能提高酶的稳定性和活性。V296F和K418I突变引起的蛋白质稳定性增加(ΔΔG稳定性)被预测为1.779 kcal⋅mol−1，表明突变体更稳定。此外，原来的氢键被破坏，另一侧形成新的氢键，这可能导致第418位氨基酸与周围残基相互作用方式的改变，从而影响突变体的最适温度、热稳定性和催化活性。综上所述，突变V296F和K418I改变了野生型BLMA的结构，包括氢键和疏水相互作用的变化，这些变化最终可能会提高突变体BLMA1的催化活性、最适温度和热稳定性。
图3
通过在面团中添加突变体BLMA1，研究了突变体BLMA1对面团品质的影响。BLMA为空白对照。混合试验的结果如表2所示。添加60ppm BLMA1和60ppm BLMA的面团在Ts、C1-C2和C3值上没有差异(p>0.05)，但C3-C4和C5-C4值有显著差异(p<0.05)。与60ppm的BLMA相比，BLMA1的C3-C4值从0.46提高到0.51，这是因为BLMA1活性较高，降低了淀粉颗粒的结构刚性。添加60ppm的BLMA1时，面团的C5-C4值比添加60ppm的BLMA降低了8%，说明BLMA1抑制淀粉重结晶的效果比BLMA好。在冷却过程中，BLMA1较好地保持了面团的弹性，减少了淀粉的重结晶。
面团也用不同浓度的BLMA1(30、45或60ppm)处理，30ppm的BLMA1效果不佳。然而，45ppm的BLMA1和60ppm的BLMA1之间没有显著差异，表明45ppm的BLMA1足以达到该酶的效果。
用45ppm的BLMA1和60ppm的BLMA处理的面团的详细结果进行了比较。与60ppm BLMA相比，添加45ppm BLMA1的面团C5-C4重结晶值较低(1.22比1.26)，C3-C4重结晶值较高(0.48比0.46)，表明45ppm BLMA1在降解淀粉和延缓重结晶方面更有效。因此，使用较低浓度的BLMA1可以获得比BLMA更好的效果。
通过比较45ppm BLMA1(面包B)、60ppm BLMA(面包A)和不加麦芽糖淀粉酶(空白)处理的面包，研究了BLMA1对面包品质的影响。面包在储存过程中的硬度和弹性如图4A所示。与空白面包相比，BLMA和BLMA1在降低面包硬度和保持弹性方面均有明显效果(p0.05)(图4A)。随着贮藏时间的延长，面包的硬度逐渐增加，但面包B与面包A的硬度差异不显著(p>0.05)，面包B的硬度比面包A低7%(第7天)和8%(第10天)。在面包质量方面，BLMA产生的效果与Novamyl 3D BG几乎相同(p>0.05)。当45ppm的BLMA1与60ppm的Novamyl相比，面包在贮藏第7天和第10天的硬度分别下降了11%和12%。
图4
图4a还显示，45ppm的BLMA1可以有效地保持面包的弹性。首先，与空白面包相比，随着贮藏时间的延长，面包B与空白面包之间的差异越来越明显(p<0.05)，说明BLMA1抑制了面包弹性的下降。此外，面包B在贮藏7天和10天后的弹性比面包A高约5%，说明45ppm的BLMA1比60ppm的BLMA对面包弹性的保持效果更好。面包贮藏第7天的感官评分如图4B所示。与空白面包相比，麦芽糖淀粉酶处理的面包(面包A和面包B)在各方面的得分都较高。面包B在外观、颜色、质地、风味和口感方面比面包A得分更高。与面包C(含60ppm Novamyl的面包)相比，面包B在质地(8.4比7.5)、风味(7.8比6.9)和味道(7.2比6.4)方面得分明显更高。这是因为BLMA1提高了面包的保湿能力。面包B的颜色和外观也会更鲜艳和更吸引人，这可能会改善面包的观感。同时，面包B的保质期更长。因此，用45ppm的BLMA1制作的面包在储存过程中保持了较好的品质。
整理：李岚雪
文章信息：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132222
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